动物实验与细胞实验方案：放线菌酮（Cycloheximide，NSC-185）——靶向真核翻译延伸的关键抑制剂别名：Actidione、Naramycin A、CHX、FT 3422-2、NM-MCD 80；化学名：环己酰亚胺；广谱抗真菌抗生素，特异性识别并稳定结合真核80S核糖体的60S亚基，高效阻滞转肽过程（CAS号：66-81-9；货号：D807418）

原创 2026-04-30 10:05:31 · DKM中国 · DKM

环己酰亚胺源自链霉菌，靶向60S核糖体亚基抑制真核蛋白合成，IC₅₀为532.5 nM，常用于CHX追踪、超诱导和核糖体图谱分析。附有动物实验细胞实验方案，仅供参考。

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环己酰亚胺（Cycloheximide, CHX）是一种抗真菌抗生素，通过阻断真核细胞的蛋白质合成发挥其广谱活性，是分子生物学研究中常用的一种转录翻译抑制剂。

1. 概述

环己酰亚胺，又称“放线菌酮”，是一种由链霉菌（Streptomyces griseus）产生的天然化合物。其编号为CAS 66-81-9，分子式C₁₅H₂₃NO₄，分子量为281.35。由于其良好的溶解性（可溶于DMSO（100mM）、乙醇（50mM）和水（25mM）），被广泛用于实验室研究。

2. 作用机制

·靶点与效应：CHX是一种特异性的真核生物蛋白质合成抑制剂，但对原核生物无效。其作用靶点位于核糖体的60S亚基，通过在蛋白质翻译的延伸阶段干扰“易位”步骤，阻止信使RNA（mRNA）的移动，从而不可逆地阻断新生肽链的延伸。

·抑制活性数据：在众多研究中，CHX的活性得到了量化：

o蛋白质合成：体内实验的半数抑制浓度（IC₅₀）为532.5 nM。

oRNA合成：在抑制蛋白质合成的高浓度下，CHX也能对RNA合成产生二次效应，其IC₅₀为2880 nM。

o其他活性：它还对多种细胞系有抑制作用，例如对人T细胞白血病细胞CEM的IC₅₀为0.12 μM。

3. 功能与应用

CHX的作用是快速且可逆的，移除药物即可恢复蛋白质合成，这使其成为研究蛋白质功能和调控的强大工具。

应用领域	具体用途	简要原理
蛋白质半衰期测定	CHX追踪实验(Cycloheximide chase assay)	加入CHX全局阻断新蛋白合成后，通过Western Blot等技术追踪某一特定蛋白随时间的衰减，从而计算其降解速率。
超诱导研究	超级诱导(Super-induction)	通过抑制大多数“短寿命”抑制性蛋白的合成，相对地延长某些“长寿命”靶蛋白的合成时间，从而显著提高其表达水平。
核糖体分析	翻译过程“冻结”	CHX能快速将正在翻译的核糖体冻结在mRNA上，这对于核糖体图谱分析（Ribosome profiling）等研究翻译调控的技术至关重要。
微生物筛选	筛选抗性菌株	由于CHX只抑制真核生物，在原核生物中无效，因此常用于酵母和真菌的抗性菌株筛选。
细胞凋亡研究	诱导或促进细胞凋亡	CHX本身可作为凋亡诱导剂，或增强肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等死亡受体的凋亡信号，用于研究细胞死亡通路。
植物学应用	植物生长调节剂	在农业上，低浓度的CHX曾被用作果实疏果剂或催熟剂，通过刺激乙烯产生来促进果实脱落。

4. 实验指导与安全信息

·溶液配制：例如，要配制50 mg/mL的储存液，可取50 mg CHX粉末溶于1 mL溶剂（如乙醇或DMSO）中。溶剂的选择应考虑下游实验的兼容性。

·工作浓度参考范围：

o细胞培养：通常为1 - 10 μg/mL。具体的最佳浓度需通过预实验（如Western Blot）在不同细胞系中进行优化和验证。

o蛋白质半衰期测定：50 - 100 μg/mL。

o酵母筛选：1 - 10 μg/mL。

·安全信息：CHX毒性很强。在使用时必须严格遵守实验室安全规程。

o剧毒：对人类经口致死剂量估计为5-50 mg/kg。

o致癌与生殖毒性：被归类为H341（怀疑会导致遗传缺陷）和H360D（可能会对胎儿造成伤害）。

o安全操作建议：

1.严禁使用移液管口吹吸。

2.接触后，用大量清水和肥皂彻底清洗受污染皮肤。

3.所有接触过CHX的废弃物（如移液器吸头、细胞培养皿）必须作为有毒化学废弃物处理。

4.操作应在化学通风橱内进行，并佩戴适当的手套、实验服和护目镜。

5. 总结

总的来说，环己酰亚胺凭借其独特的真核特异性蛋白合成抑制机制，在生物医学研究中扮演着经典工具试剂的角色。通过有效阻断蛋白质的翻译过程，它被广泛应用于测定蛋白质半衰期、研究翻译调控机制等领域。

以下是环己酰亚胺（CHX）用于动物和细胞实验的方案汇总，并附有关键注意事项。

储存液配制

项目	说明
溶剂选择	常用蒸馏水、PBS或DMSO。不建议使用浓度过高的有机溶剂直接处理细胞，必要时用培养基稀释至工作浓度。
常用储存液浓度	- 用于细胞实验：建议配制成10 mg/mL的储存液，过滤除菌后分装冻存。
	- 用于CHX追踪实验：可用蒸馏水配制成0.1 mol/L的储存液，-20℃保存；如不溶可微热至40℃助溶。
	- 用于动物实验：用0.9%生理盐水新鲜配制，现配现用。参考浓度：0.4 mg/mL。
工作浓度参考	-细胞培养：常用10～100 μg/mL。
	-CHX追踪测定：常用35 μg/mL或50～100 μg/mL。
	-筛选抗性酵母/真菌：1～10 μg/mL。

CHX作用迅速，加入培养基后几乎立即起效。确认抑制效果可采用放射性标记氨基酸掺入试验（如³⁵S-甲硫氨酸脉冲、TCA沉淀法）。仅依赖考马斯亮蓝染色全细胞裂解物灵敏度不足。如涉及DMSO，其在终体系中的体积分数不宜过高（通常<0.1%）。

细胞实验方案

1. CHX追踪法测定蛋白质半衰期

该方法通过阻断新蛋白合成来追踪特定蛋白随时间衰减的速率，是研究蛋白质降解动力学的经典手段。

基本步骤：

·细胞准备：培养贴壁细胞至80–90%融合度（约每孔3,000–5,000个细胞）。

·CHX处理：加入CHX至终浓度35 μg/mL（或通过预实验确定最佳浓度），开始计时。

·样本收集：在0、2、4、6、8小时等不同时间点收集细胞，用PBS洗涤后裂解。裂解液可经4℃、15,000g离心5–15 min去除不溶物。

·检测与定量：通过SDS-PAGE分离蛋白质，利用目标蛋白特异性抗体进行Western Blot检测。扫描条带灰度值，绘制衰减曲线，计算半衰期。

**注意事项**：建议同时检测稳定表达的蛋白（如Tubulin, Actin）作为上样内参。所测半衰期取决于蛋白本身的降解速率，不同蛋白差异很大。

2. CHX在细胞培养中的通用方案

实验目的	推荐浓度	处理时间	参考文献
抑制新蛋白合成	10–100 μg/mL（常用35 μg/mL）	5–10 min 至数小时
蛋白质半衰期测定	50–100 μg/mL（或35 μg/mL）	0–8 小时（逐时取样）
细胞生长停滞（一般用途）	35–50 μg/mL	持续处理，取决于实验目标
快速翻译“冻结”（如核糖体分析）	100 μg/mL	加入后立即进入后续流程
抑制真核翻译（制备粗微体）	10 μmol/L（≈2.8 μg/mL）	5–10 min
筛选抗CHX酵母/真菌菌株	1–10 μg/mL	持续培养筛选
诱导细胞凋亡	1–20 μg/mL	数小时至24小时

CHX抑制蛋白质合成通常为**不可逆**作用。处理时间过长或浓度过高可能导致细胞毒性，宜根据实验目标和细胞类型进行优化。

3. 测定CHX对细胞增殖的影响

方法示例：HeLa、Jurkat等细胞悬液按每孔3,000–5,000个接种于96孔板，过夜贴壁。第二天加入0.1 nM–1000 μM的CHX（DMSO溶解），继续培养24小时。每孔加入1 μCi ³H-胸苷，继续孵育7小时。用多孔收集器将细胞收集于滤膜，闪烁计数测定胸苷掺入量。

动物实验方案

特殊应用中的小鼠给药参数汇总

实验类型	动物品系	剂量范围	给药途径	给药时机与频次
记忆巩固障碍模型	昆明小鼠	120–150 mg/kg	i.p.	训练后立即或训练前10 min/30 min，单次注射
被动回避记忆研究	C57BL/6J	失忆剂量150 mg/kg；亚失忆剂量30 mg/kg；二次追加15–75 mg/kg	i.p.	训练后0、30 min或1 h注射
抑制脑蛋白质合成（评估）	ICR小鼠	30 mg/kg抑制约80%脑蛋白合成 120–150 mg/kg抑制约95%	i.p.	注射后30–60 min测定
艾利希腹水癌细胞研究	常规小鼠品系	30–60 μg/g（即30–60 mg/kg）	i.p. / i.v.	肿瘤细胞注射前后2–18 h给药
免疫调节研究	白色小鼠	12.5, 25, 50 mg/kg	i.p. / i.v.	按注射次数给药（周期依实验而定）
腹膜腔给药（常规参考）	常规小鼠品系	0.2 mg/110 g（约1.82 mg/kg）	i.p.	单次注射，持续观察5–10天
口服给药（长期低剂量）	SD大鼠	0.25 mg/kg	口服灌胃	Daily，持续5天
癫痫模型（匹罗卡品）	SD大鼠	1 mg/kg	i.p.	PILO给药前30–45 min单次注射
淋巴吸收研究	SD大鼠	0.5 mg/kg（药代）；2.5 mg/kg（药效）	oral / i.p. / i.v.	与脂质或药物联合给药，单次或少量多次
植入研究/妊娠研究	SD大鼠	1 mg/kg	i.p.	人工蜕膜诱导后立即，或妊娠第4天晚上/第5天早上单次注射

**备注**：i.p. = 腹腔注射；i.v. = 静脉注射；oral = 口服。

一般性给药建议

动物模型	常用剂量（参考）	给药途径	典型用途	效果参考
小鼠（Mus musculus）	30–120 mg/kg	i.p.	记忆研究、蛋白合成抑制、毒性评估	蛋白合成抑制80–95%
小鼠（短期处理/低毒性）	1–10 mg/kg	i.p. / oral	特定组织功能研究、免疫调节	低毒或无可见毒性
大鼠（Rattus norvegicus）	0.25–2.5 mg/kg	oral / i.p. / i.v.	药代动力学、淋巴吸收、胚胎植入研究	有效抑制蛋白合成，淋巴吸收降低24–40%

关键注意事项

1.物种特异性：小鼠与大鼠对CHX的敏感性相差悬殊。抑制大鼠蛋白合成所需的CHX剂量（1–3 mg/kg）远低于小鼠，导致遗忘所需的剂量也比小鼠低得多。大鼠的LD50值也远低于小鼠，在借鉴文献剂量时务必核实动物品系。

2. **肝毒性**：即使是相对中低剂量（如2.5 mg/kg），CHX也能引起血浆脂质显著降低（24–40%），并可能伴有炎症反应和肝酶升高（如ALT/AST），且在给药后仍可持续一周。

3. **记忆效应与剂量**：CHX诱导遗忘并非简单的剂量依赖关系，有时呈倒U型曲线。30 mg/kg的低剂量可能足以增强记忆，而更高剂量（如120 mg/kg）反而产生遗忘。给药时机（训练前、训练后立即、训练后30 min或1 h）也显著影响效果。建议将CHX作为干预剂时开展剂量−效果预实验。

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存储建议

·粉末状：-20℃保存，通常可稳定3年。

·储存液（溶剂）：-80℃保存，通常可稳定6个月以上。分装避免反复冻融。

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